大家好，关于凝胶色谱法很多朋友都还不太明白，今天小编就来为大家分享关于凝胶色谱的实验技术的知识，希望对各位有所帮助！
凝胶色谱分离原理高中
凝胶色谱法的原理是：凝胶色谱法的固定相为多孔性凝胶类物质，流动相为水溶液或有机溶剂，它是根据不同组分子体积的大小进行分离的。
小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过，而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰，全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。
凝胶渗透色素法的基本操作方法
1.溶剂的选择
能溶解多种聚合物;不能腐蚀仪器部件;与检测器相匹配。
2.把激光光散射与凝胶色谱仪联用
在得到浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量。
3.样本的准备
激光光散射实验中必须对样品严格除尘。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应进行精馏，并经过0.2μm超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.2μm的超滤膜过滤。另外，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水强力冲洗。
4.GPC色谱柱选择
(1)按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列
THF、LV仿、DMF
必须选择合适的溶剂来溶解聚合物
(2)按照样品分子量范围来选择柱子型号
样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且应该处在校正曲线线性范围内
5.GPC仪器对载体的要求
(1)良好的化学稳定性和热稳定性;
(2)有一定的机械强度
(3)不易变形;
(4)流动阻力小
(5)对试样没有吸附作用
(6)分离范围越大越好(取决于孔径分布)等
(7)载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧密，色谱柱分离效率愈高。
6.进样体积
50-100uL之间(浓度在0.05%-0.5%之间)
7.GPC系统如何平衡
(1)安装色谱柱之前，用两通管连接管路，用流动相替换系统后换上GPC柱子。(注意溶剂互溶情况)
(2)RID平衡操作
分析开始前，用流动相冲洗检测器流路。
流动相流速1ml/min，切换到RFlow，使流动相通过检测池的样品池和参比池，冲洗20min左右。
然后切换RFlow流路数次，将气泡赶出检测池。
关闭RFlow，等待基线平稳。
当Balance值高于50，进行Balance调整。
(3)色谱柱平衡
等溶剂峰出峰后在经过约一次分析时间后基线才能走平。
凝胶色谱的实验技术
凝胶色谱法分离蛋白质原理：
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出。
凝胶色谱法模拟实验
(一)层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。
(二)凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好，脱盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
(三)凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
(四)样品溶液的处理样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4%，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4%(一般约0.5-2ml)，进行分族分离时样品液可为凝胶床的10%，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30%。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。
(五)防止微生物的污染交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：
⑴叠氨钠(NaN3)在凝胶层析中只要用0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40%；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01%。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
⑷苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01%。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
好了，关于凝胶色谱法和凝胶色谱的实验技术的问题到这里结束啦，希望可以解决您的问题哈！
